مواد و وسایل موردنیاز:

 

نمونه خون  cc 2 ، لیز بافر (Lysis Buffer ) ، محلول SE ، محلول سدیم دو دسیل سولفات)  (SDS ، پروتئیناز K محلول ، Nacl اشباع ، کلروفرم , اتانول مطلق ، الکل 70% ، آب مقطر استریل ، سانتریفوژ ، سمپلر، میکروفیوژ ، میکروتیوپ، پارافیلم ، بن ماری ، پیپت حبابدار

  روش انجام آزمایش:

 2 سی سی خون درون لوله ی آزمایش ریخته و سپس روی آن 6 سی سی لیز بافر سرد میریزیم ( که PH=8 دارد ) که این عمل موجب لیز و متلاشی شدن گلبولهای قرمز می شود و در لوله را با پارافیلم بسته و آرام سر و ته می کنیم تا حل شود . حدود 15 دقیقه محلول را در یخچال قرار می دهیم این عمل موجب شکننده شدن غشاء گلبولهای قرمز می شود  سپس 15 دقیقه سانتریفوژ 1800 rpm روی لوله انجام داده که این امر موجب می شود ته لوله رسوب تشکیل شده که حاوی گلبولهای سفید می باشد و محلول رویی قرمز رنگ را دور میریزیم ( چون گلبول قرمز ماده ی وراثتی ندارد )  . دوباره برای رسوب مراحل را از اول انجام می دهیم :

دوباره لیز بافر به مقدار cc 4 اضافه کرده و هم میزنیم و به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ 1800 rpm می کنیم و دوباره محلول رویی را بیرون ریخته و رسوب سفید رنگ را برای مراحل بعدی حفظ می نماییم .

بافر SE حدود cc 2 روی رسوب بدست آمده ریخته تا گلبول سفید لیز شود و حدود 400 میکرولیتر محلول SDS 10 % به محلول اضافه میکنیم که موجب از بین رفتن فسفولیپیدها شده و غشاء را از هم باز می کند .

حدود 10 میکرولیتر پروتئیناز K به محلول اضافه می کنیم که باعث می شوم پروتئینها لیز شوند .  و لوله را دوباره سرو ته کرده تا رسوب کاملا از ته لوله جدا شود سپس لوله را در بن ماری 45 درجه ( یک شب )قرار می دهیم تا پروتئیناز K در آن عمل نماید و پروتئینها لیز شوند . روز بهد دمای بن ماری را در 67 درجه تنظیم کرده و یک ساعت در آن دما محلول را قرار می دهیم تا پروتئیناز K غیر فعال شده و حذف گردد سپس آن را از بن ماری بیرون آورده و روی آن cc 1 نمک طعام اشباع میریزیم . مایع بدست آمده کدر خواهد بود زیرا پروتئینهایی که دناتوره شده بودند از حالت محلول به حالت نامحلول در می آیند + و – بودن پروتئین باعث می شود تا محلول باشند و وقتی NaCl اضافه می شود تمام محلهای + و – توسط نمک طعام پر می شود و بار الکتریکی آن صفر می شود بنابراین به صورت کدر و نامحلول در می آیند . حدود 1.5 سی سی کلروفرم به محلول افزوده که موجب دناتوره شدن پروتئین ها می شود. دوباره سانتریفوژ را  به مدت 1 ساعت در دور  4000 rpm  بر روی محلول انجام می دهیم .

در نتیجه قسمت پایین کلروفرم ، قسمت وسط prهای غیرمحلول، قسمت بالا محلول آبی است . محلول آبی را به یک لوله ی دیگر منتقل کرده و سپس روی آن اتانول مطلق سرد  اضافه می کنیم ( حدود cc 6 ) آرام محلول را سرو ته کرده تا دو لایه تشکیل شود که محلول DNA در پایین و الکل در بالای لوله قرار گرفته و مابین این دو لایه یک هاله ی مه آلودی تشکیل می شود . سپس اقدام به بستن سرلوله با پارافیلم و آرام تکان دادن می کنیم  تا DNA به صورت گلوله و کلاف دربیاید و با استفاده از یک پیپت حباب دار کلاف را از لوله در آورده و به یک میکروتیوپ انتقال می دهیم و آن را سانتریفوژ (10 ثانیه در 10000rpm میکروفیوژ ) می کنیم تا کلاف به میکروتیوپ بچسبد . محلول را با سمپلر بیرون کشیده و دور میریزیم .

روی کلاف و در داخل میکروتیوپ 100 تا 200 مایکرولیتر اتانول 70 %  می ریزیم تا اگر روی کلاف نمک باشد در فاز آبی حل شود بعد دوباره میکروفیوژ کرده و مایع رویی را بیرون می ریزیم . یک تا دو مرتبه این کار را تکرار می نماییم .

چون کلاف سفید DNA نم است آن را در دمای اتاق و زیر نور خورشید به مدت 5 تا 10 دقیقه قرار داده تا DNA‌ خشک شده و شکل کریستالی پیدا کند . سپس 100 میکرولیتر آب مقطر استریل روی کلاف ریخته و به مدت یک روز در دمای اتاق نگه داری می کنیم تا DNA در آن حل شود  و بعد به فریزر انتقال می دهیم

 

نتیجه : DNA از خون استخراج و آماده ی PCR است

در پایین و الکل در بالای لوله قرار گرفته و مابین این دو لایه یک هاله ی مه آلودی تشکیل می شود . سپس اقدام به بستن سرلوله با پارافیلم و آرام تکان دادن می کنیم  تا DNA به صورت گلوله و کلاف دربیاید و با استفاده از یک پیپت حباب دار کلاف را از لوله در آورده و به یک میکروتیوپ انتقال می دهیم و آن را سانتریفوژ (10 ثانیه در 10000rpm میکروفیوژ ) می کنیم تا کلاف به میکروتیوپ بچسبد . محلول را با سمپلر بیرون کشیده و دور میریزیم .

روی کلاف و در داخل میکروتیوپ 100 تا 200 مایکرولیتر اتانول 70 %  می ریزیم تا اگر روی کلاف نمک باشد در فاز آبی حل شود بعد دوباره میکروفیوژ کرده و مایع رویی را بیرون می ریزیم . یک تا دو مرتبه این کار را تکرار می نماییم .

چون کلاف سفید DNA نم است آن را در دمای اتاق و زیر نور خورشید به مدت 5 تا 10 دقیقه قرار داده تا DNA‌ خشک شده و شکل کریستالی پیدا کند . سپس 100 میکرولیتر آب مقطر استریل روی کلاف ریخته و به مدت یک روز در دمای اتاق نگه داری می کنیم تا DNA در آن حل شود  و بعد به فریزر انتقال می دهیم

 نتیجه : DNA از خون استخراج و آماده ی PCR است

 مقدمه ای بر آزمایش :

 این تکنِِیک در اواسط دهه ی 1980 بوسیله ی کری مولیس معرفی شد .تکنیک PCR کاربردهای نا محدودی در عرصه های مختلف ژنتیک دارد ، علت اصلی این امر این است که DNA الگوی بکار رفته در PCR را می توان از منابع مختلف تامین کرده و مورد استفاده قرار داد .بطور کلی PCR به دو منظور اصلی بکار می رود :

1 تهیه ی  نسخه های متعدد از یک ژن

2 بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در یک قطعه DNA

 وسایل و مواد مورد نیاز :

DNAی الگو ، پرایمرهای Forward و Reverse ، Taq polymerase،‌ دزوکسی نوکلئوزید تری فسفاتها (dNTPs) ، محلول بافر ، کاتیون یک ظرفیتی ، کاتیونهای دو ظرفیتی ، آب مقطر استریل

 شرح انجام آزمایش :

 ابتدا در یک میکروتیوپ مواد زیر را با نسبتهای ذکر شده تهیه می کنیم :

* آب مقطر استریل 15.8 میکرولیتر

* پرایمر ( 1 میکرولیتر  Forward و 1 میکرولیتر Reverse ) به گونه ای طراحی شده اند که هر یک مکمل ناحیه َ3 در یکی از رشته های DNA باشد .

* dNTP 0.5 میکرولیتر 

* بافر 2.5 میکرولیتر

* یون Mg2+0.5 میکرو لیتر

Taq DNA polymerase 0.2 میکرولیتر

* DNA الگو 3 میکرولیتر

ابتدا آب را ریخته بعد DNA ( به دست آمده از آزمایش اول ) و آنزیم را آخر میریزیم

لوله هل در بلوکهای مخصوصی در دستگاه ترموسایکلر قرار داده میشوند. ترمو سایکلر، طبق برنامه ریزی انجام شده، دمای لوله ها را در زمانهای مشخصی افزایش و کاهش میدهد تا مراحل مختلف PCR انجام شود. برای جلوگیری از تبخیر محلول (و در نتیجه افزایش غلظت در بخشهای بالائی محلول)، معمولا یک لایه روغن بر سطح محلول قرار داده میشود. ولی در دستگاه های جدیدتر از درپوش های حرارتی استفاده میشود.

 نتیجه : قسمت مورد نظر از  DNA تکثیر شده و آماده ی الکتروفورز است

     الکتروفورز

 مقدمه ای بر آزمایش :

 

الکتروفورز به حرکات ذرات در مایع تحت میدان الکتریکی  می گویند

نمونه هایی که بار الکتریکی دارند، تحت تأثیر یک میدان الکتریکی از میان شبکه ای متخلخل حرکت می کنند و از یکدیگر جدا می شوند.

کاربرد:تعیین جرم مولکولی نسبی -(Mr) مشخص کردن غلظت پروتئین و...

 برای جداسازی در یک میدان الکتریکی آنها را بر اساس  خواص فیزیکی مثل : وزن مولکولها شکل مولکول-یابارالکتریکی شان-درمیدان الکتریکی-آنهاراازهم جداسازی می کند

کروماتوگرافی داخل ژل ها انجام می شود ژل آگار-ژل آکریل آمیدیاپلی اکریل آمید

الکتروفورز ژلی : از یک محیط نیمه جامد (ژل ) بعنوان فاز ثابت استفاده میشود. این نوع الکتروفورز برحسب نوع ژل به کار گرفته شده به دو نوع الکتروفورزتقسیم بندی می شوند :ژل پلی اکریل آمید ( PAGE) و الکتروفورز ژل آگارز

الکتروفورز PAGE دارای قدرت تفکیک بسیار بالائی بوده و برای تفکیک پروتئین ها و اسید های نوکلئیک به کار گرفته می شود.

برای تفکیک اسیدهای آمینه معمولا  از ژل آگار استفاده می شود به این دلیل که تهیه ی ژل سریعتر آسان تر  ، بی خطر تر و ارزان تر از ژل آکریل آمید است  . قدرت تفکیک ژنها ی مزبور ارتباط مستقیمی با غلظت آنها دارد برای مثال برای تفکیک قطعاتی به اندازه ی 100 جفت باز از آگاروز 3 % و برای قطعات حدود 2000 جفت باز از آگاروز 80 % استفاده می شود

آگار یک ماده پلی ساکارید که ازیک جلبک به دست می آید و بر اساس جوش دادن همگن کردن وسردکردن  آگار تهیه می شود.

ژل راداخل تانک الکتروفورزقرارمی دهند محلول بافررااضافه کرده که خاصیت تامپونی دارد بافرهاخاصیت آمفی دارندتنظیمPH  یکالکترولیزانجاممیدهدبههمینخاطرازبافراستفادهمیشود

DNAبارمنفیداردبه خاطرگروه فسفات ازطرف منفی به طرف مثبت حرکت می کند که اندازه شان یکسان است انواع مولکول هم وجوددارد.

براساس اندازه بارالکتریکی وشکلی که دارندازیکدیگر جدامی شوند و ژل بعد از الکتروفورز باید رنگ آمیزی شود  برای این کارازماده ای به نام اتیدیوم بروماید یک ماده شیمیایی دسرطان زا است ت استفاده می کنیم و دارای  خاصیت فلورسانس است ماده نور UV راجذب می کندونورنارنجی ازخودنشان می دهد  ظهوربانددردستگاه دیده می شود

الکتروفورز از یک تانک حاوی بافر مشخص به همراه یک منبع تغذیه و ژل آگارز تشکیل شده است

 وسایل مورد نیاز :

بافر ، ژل ، منبع ، دستگاه الکتروفورز ، اتیدیو بروماید ، سمپلر ، زیلن

 روش انجام آزمایش :

ابتدا مقداری آگاروز  را در بشر حاوی آب می جوشانیم تا همگن شود سپس آن را داخل ظرف حاوی اجزای شانه مانند ( برای ایجاد چاهک در ژل ) میریزیم و نیم ساعت صبر می کنیم تا ماده ی نیمه جامد شبیه ژل بدست آید سپس در داخل دستگاه الکتروفورز که سر آن را به قطب مثبت و سر دیگر آن را به قطب منفی منبع وصل کرده ایم ژل را داخل آن می اندازیم . نمونهیموردنظر  ازبافر-زیلنرنگآبیتیره +گلیسرول +ومحلولpcr را با سمپلر مخلوط کرده و در داخل چاهکها loding می کنیم .بعدازانجامتماممراحلدکمهاستارترازدهوبهزمان 30 دقیقه  تنظیممیکنیم  بعدازاتمامشدنالکتروفورزنمونهراهمراهژلداخلمحلولاتیدیومبروماید  گذاشته  مواظبباشیمکهمحلولسمیوسرطانزااست 10دقیقهصبرکرده  ونمونهراباژلبرداشتهباآبشستشودادهبهآرامی  در زیرنورuvقرار می دهیم درجاهایکهDNAوجودداردبهرنگروشنمشاهدهخواهدشد نبودنورروشننشانهنبود DNA است البتهبهشرطاینکهکارراصحیحانجامدادهباشیم  .